甲肝:免疫损伤
1.5.2 PT测定，自动凝血仪(比浊法)，直接报告PT(±s)，同时加做正常对照。
1.2 实验动物及肝纤维化模型制作 健康Wister大鼠40只，5月龄，雌雄各半，体重214. 7±25g，北京医科大学动物养殖中心提供。饲养观察1周后用于实验。按性别进行区组设计，随机分为正常对照组、模型组（实验对照组）、高剂量治疗组、低剂量治疗组，每组10只（雌雄各半）。除正常对照组外，每周给其他3组大鼠腹腔注射猪血清2次，每次0. 5ml/只，连续8周。制成肝纤维化模型。
模型组肝细胞肿胀，胞质内出现大量空泡，小叶内和小叶间、汇管区等间质细胞成分和纤维成分明显增高，肝细胞核变形或稍固缩，细胞边界不清楚，胞质不均匀或大空泡（图2）。Mallory染色时，可见大量蓝绿色粗大的胶原纤维束，呈放射状插入肝小叶，将肝脏分割成以汇管区为中心的假小叶。经彩色图象分析仪统计，可见肝内胶原纤维面密度明显高与其他组（表3）。治疗后大剂量组肝细胞内空泡减少，纤维成分减少；而小剂量组纤维成分较少不明显（图3、4）。
3 讨论
2.2 肝功能改变
1.1.2 自动血凝仪及相关试剂，用于PT测定。
3.1 猪血清诱发大鼠免疫损伤性肝纤维化的机理，主要是血清引起机体产生可溶性免疫复合物，激活补体。由于肝细胞表面存在Fc受体，可与免疫复合物结合而沉积于细胞膜，导致肝细胞损伤并激发肝细胞、贮脂细胞和成纤维细胞增生，表现为Ⅲ型变态反应。本模型与临床乙型肝炎病毒引起的慢性活动性肝炎和肝硬化与自身免疫应答及免疫调节功能紊乱有相似性，故对指导临床研究有很重要价值。
1.6 形态学检查 快速处死动物，肝脏多部位取材，液体石蜡包埋，制备冰冻切片，分别进行HE、Mallory和免疫组化染色，光学显微镜观察肝小叶结构和胶原纤维密度，用网格计数器计数吞噬细胞和储脂细胞密度。
2.3 形态学观察(HE和Mallory染色) 正常组大鼠肝脏中以肝细胞为主，结缔组织和间质细胞较少，因此肝小叶分界不明显，肝小叶间汇管区可见小叶间A、V和胆管，其中结缔组织和纤维成分较少；胶原纤维成分也很少。肝细胞为多边形，边界可见，胞质弱嗜酸性，均匀一致，胞核呈圆形，1～2个，嗜碱性（图1）。
2.2.2 治疗前后大鼠凝血酶原时间的变化（表2），各组均与模型组（实验对照组）比较。表2 各组大鼠凝血酶原时间（PT）测定结果注：各组均与实验对照组比较表2显示：血浆凝血酶原时间（PT），实验对照组较治疗组明显延长，差异极为显著（P<0. 0005）。
3.3 祖国医学著作（失血大法）阐述：“失血一症，大抵由于肝不藏血，脾不统血”；缪仲醇《先醒斋医学广笔记·吐血篇》云“吐血者，肝失其职也”；近代周炳麟认为：“血症之患，肝脏首当其冲”，可见肝、脾与血症的密切关系。肝藏血功能指肝有贮存血液、调节血量和化生血液的作用。血浆蛋白不仅是构成血液的主要成分，并且对维持渗透压、保持凝血-抗凝和纤溶的动态平衡起着重要的作用。肝不藏血之说虽不能等同于肝病出血，但包括在其范围之内，各种致病因素损及肝脏，将会使肝藏血、化生血液成分的功能受到影响，表现为蛋白质合成减少和凝血、抗凝及纤溶障碍。从而导致出血或血栓形成。
2.1 一般状况观察 肝损伤大鼠在实验初期毛发光亮、一般状态良好。与正常对照组大鼠相比，饮食、饮水无异常变化，4～7周后，实验组较对照组体重增长缓慢，8～11周治疗期间体重增长较快，且大剂量组明显优于小剂量组。
图6 阳性贮脂细胞胞质呈棕黄色S-MA免疫组化染色400×
凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ是由肝细胞合成的维生素K依赖性凝血因子。肝纤维化（硬化）时，在肝损伤尚未引起循环衰竭的情况下，大鼠PT延长，临床表现为出血倾向。由于：①肝细胞损害时，蛋白质合成功能低下，维生素K吸收障碍，使维生素K依赖性凝血因子的前体不能转化为有活性的凝血因子。导致凝血障碍。②肝病变时，由于肝细胞功能紊乱，合成肝素酶的功能降低，使肝脏对肝素或肝素类物质的灭活能力下降，血浆中肝素浓度增加，抗凝活性增强。③肝功能障碍引起凝血因子合成减少，最先影响FⅦ，其次是FⅡ，最后是FⅤ和FⅩ。相对于内源性凝血途径和其他因子而言，FⅦ的生物半寿期最短（6～8h），因此在反映肝源性凝血障碍和功能恢复的检测指标中，PT较为敏感。本研究高剂量治疗组PT较正常对照组略低，但该差异无临床意义（<3s）。
1.3 中药组方：黄芪、蜈蚣、三七、山慈姑、郁金、枳实、白术。采用现代中药制剂工艺，通过质量监测、稳定性实验、卫生学检查等环节制成标准颗粒剂备用。临时按剂量要求配成水溶液即可服用。
1.4 肝纤维化大鼠的药物治疗 分别给低剂量、高剂量治疗组以制备好的中药颗粒溶液灌胃，剂量分别为1g/1ml/100g体重、2g/1ml/100g体重；1次/d，共4周。
本研究在给模型组采血时发现，即使采血很顺利，血液和抗凝剂及时彻底的混合，仍有2只大鼠采血后立即发生了凝血，可见少部分肝纤维化的大鼠已处于高凝状态。血浆凝血酶原时间延长固然与FⅦ合成不足有关，但也不排除由于凝血因子的提前过度消耗而引起继发性凝血障碍。
1.1.1 日立7150自动生化分析仪及相关试剂，测定血清ALT及A、G（A/G）。
吞噬细胞和储脂细胞模型组显著高于正常对照组（表4），治疗后略有降低，高剂量组较低剂量组降低明显（图5、6）。表3 肝间质胶原纤维密度（Mallory染色）（面密度/μm2，x±s）注：*与正常组比较有显著性差异P<0. 05;Δ与模型组比较有显著性差异P<0. 05 表4 储脂细胞和巨噬细胞计数（个/视野）（免疫组化染色）（±s)
3.4 中药复方针对肝纤维化的病机特点（本虚标实），据治肝补脾原则组方，达益气健脾、理血软肝之功效。其作用机理为：①有效地保护肝细胞，减轻肝细胞变性坏死的程度。如：黄芪、白术可保护肝细胞，促进肝糖原合成；郁金（姜黄素）对肝细胞损害有抑制作用；山慈姑（秋水仙碱）有促进肝细胞再生，减少肝小叶变性坏死的作用。②有效地调节免疫功能。其中黄芪（黄芪多糖）、白术能增强机体免疫活性，对细胞免疫、体液免疫和非特异免疫均有调理作用。③有促凝和抗凝活性，控制出血、凝血倾向。三七有明显的护肝作用，使肝细胞合成凝血因子和灭活肝素类物质的能力不至严重减低，纠正凝血时间和凝血酶原时间；白术有抗凝血作用，枳实可增加冠脉流量，减少血管阻力，改善肝脏微循环。④抑制胶原纤维增生，预防和延缓肝硬变的发生。山慈姑的主要成分为秋水仙碱，能抑制肝内储脂细胞(结蛋白阳性细胞)的增殖和转化，减少胶原合成及在肝窦周沉积［6］，从而减轻肝脾肿大，延缓肝硬变的发生。蜈蚣能解毒软坚，组织切片观察结果也证实了这一作用。因此，中药复方在保护肝脏（恢复肝功能）、改善肝脏微循环、抗肝纤维化和改善出血倾向等方面起到明显疗效，是临床有待开发应用的良方。
2 结果
1.5 给各组动物心脏采血，制备血清及枸橼酸钠（1:9）抗凝血浆用于以下测定。
1.1 仪器或试剂
1.5.1 ALT、A、G测定，自动生化分析仪预热30min后,常规测定血清蛋白浓度g/L（±s），计算A/G。
肝纤维化在不同进展时期引起相应的形态及功能改变。中医药治疗免疫损伤性肝纤维化有得天独厚的优势，但在实验研究及临床报道中，不同医家所报道的组方形式及观察指标各有侧重。本文就肝纤维化大鼠模型治疗前后肝细胞功能及肝小叶组织的形态学变化对芪蚣抗纤方的疗效进行全面评价。
1 材料与方法
3.2 反映肝细胞损伤最敏感的指标为转氨酶，肝损伤急性期，转氨酶明显升高，疾病发展到慢性期则维持在略高的水平。此时蛋白质的变化更为明显。血浆中的白蛋白主要在肝细胞内合成，肝纤维化（硬化）时，正常肝细胞数目减少，单核巨噬细胞增生，表现为血浆白蛋白降低，球蛋升高，A/G下降甚至倒置。经有效治疗后，随着肝细胞的再生，蛋白质合成功能得到恢复。
2.2.1 治疗前后各组ALT、A、G及A/G测定结果（见表1）。表1 血清ALT、A/G变化情况表1显示：与正常对照组比较，模型组ALT显著升高（P<0. 001）,A/G比值显著低于正常组（P<0. 05）。而高低剂量治疗组ALT均低于模型组（0. 01
中药复方对免疫损伤性肝纤维化大鼠肝损害的疗效观察
